隨著國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，種子轉(zhuǎn)基因檢測已成為種子檢驗的重要項目。我國目前除了棉花以外，尚未批準(zhǔn)其他主要農(nóng)作物的轉(zhuǎn)基因商業(yè)化種植，目前對待轉(zhuǎn)基因種子是一票否決制，任何非法轉(zhuǎn)基因種子品種都不能進(jìn)入審定、生產(chǎn)和銷售環(huán)節(jié)，因此種子轉(zhuǎn)基因檢測是種子市場監(jiān)管的重要技術(shù)支撐。目前種子轉(zhuǎn)基因檢測以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，PCR技術(shù)的基本原理是以一段特定的核酸分子為模板，通過引物延伸重復(fù)性地合成雙鏈DNA。PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，在種子轉(zhuǎn)基因檢測方面發(fā)揮了重要作用。

      PCR技術(shù)的優(yōu)越性在于它特異性和靈敏度非常高，能夠檢測到微量的核酸序列。但正是由于它的高效擴(kuò)增能力，在應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行種子轉(zhuǎn)基因成分檢測過程中，不可避免地會遇到各種影響結(jié)果質(zhì)量的問題，尤其是檢測污染的問題。種子轉(zhuǎn)基因檢測實驗室污染會導(dǎo)致假陽性結(jié)果，將原本應(yīng)該是“未檢出轉(zhuǎn)基因”的種子，誤判為“檢出轉(zhuǎn)基因”的種子，嚴(yán)重影響種子企業(yè)對種子的后續(xù)處理，給種子企業(yè)造成巨大的損失。

      陜西省農(nóng)作物種子檢驗站近年來多次承擔(dān)省部級種子轉(zhuǎn)基因檢測任務(wù)，以及各地市和省內(nèi)外種子企業(yè)委托的種子轉(zhuǎn)基因檢測樣品檢測任務(wù)。2010-2022年累計檢測種子轉(zhuǎn)基因樣品17010份。工作中，陜西省農(nóng)作物種子檢驗站科學(xué)合理地制定檢測方案，采取各種措施應(yīng)對種子轉(zhuǎn)基因檢測實驗室的污染問題，也總結(jié)了大量經(jīng)驗和教訓(xùn)，為種子轉(zhuǎn)基因監(jiān)管提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

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      種子轉(zhuǎn)基因檢測實驗室污染來源分析

       1.1   樣品間污染

      目前除了棉花，我國尚未批準(zhǔn)其他主要農(nóng)作物的轉(zhuǎn)基因商業(yè)化種植，一般種子市場抽查和品種試驗檢測的種子樣品預(yù)期結(jié)果大多數(shù)情況下是“未檢出”，因此轉(zhuǎn)基因成分檢測目標(biāo)是“意外混入檢測”（AP檢測）。

      但是，從近幾年的檢測結(jié)果看，每年都會出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因檢測為“檢出”的樣品，每年樣品陽性率在1%以下（包括能力驗證中的陽性樣品），如表1所示。同這些陽性樣品同一批次進(jìn)行檢測的樣品，需要同步進(jìn)行樣品流轉(zhuǎn)、粉碎研磨、核酸提取、配置體系、擴(kuò)增電泳等操作，稍不注意就會產(chǎn)生假陽性結(jié)果?？梢姡瑯悠烽g污染是轉(zhuǎn)基因檢測污染的重要來源。

       1.2   PCR產(chǎn)物污染

      種子轉(zhuǎn)基因檢測是通過對目標(biāo)核酸片段進(jìn)行成百萬倍的復(fù)制，來檢測目標(biāo)核酸片段是否存在于樣品中。如果擴(kuò)增成功，表明含有該核酸片段；如果未檢測到產(chǎn)物，說明樣品中不含有該核酸片段。

      核酸擴(kuò)增是進(jìn)行指數(shù)級擴(kuò)增的，每一次擴(kuò)增的產(chǎn)物，都是下一次擴(kuò)增的模板。每一次成功的擴(kuò)增，都會產(chǎn)生百萬數(shù)量級的模板。而以PCR擴(kuò)增的靈敏度，擴(kuò)增步驟，也會產(chǎn)生假陽性結(jié)果?？梢姡總€陽性樣1個模板就會檢出。即使有微量的產(chǎn)物進(jìn)入品或者對照的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物都是重要的污染來源。

       1.3   試劑污染

      PCR檢測過程需要提取、擴(kuò)增和電泳的各種試劑，涉及種類多，操作過程中氣溶膠或者液體飛濺，都有可能造成試劑污染。使用污染試劑進(jìn)行樣品檢測，會將“未檢出”誤判為“檢出”的樣品，造成假陽性結(jié)果。

      試劑污染的另一個方面，是針對轉(zhuǎn)基因的某些檢測靶標(biāo)的，即某些檢測元件總是出現(xiàn)假陽性結(jié)果。這是由于PCR擴(kuò)增的關(guān)鍵試劑-耐熱擴(kuò)增酶是由基因工程菌生產(chǎn)的，這些耐熱擴(kuò)增酶在生產(chǎn)提純的過程中，會不可避免地帶有某些基因工程菌的核酸片段，比如常見的抗新霉素的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（NPTII基因）的核酸片段。NPTII基因也是轉(zhuǎn)基因植物常用的篩選基因之一。如果耐熱擴(kuò)增酶在生產(chǎn)中使用了該基因，且提純的過程中沒有完全去除，則必然造成假陽性結(jié)果。

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      種子轉(zhuǎn)基因檢測實驗室污染防控

       2.1   實驗室布局

      合理的實驗室布局能夠有效減少種子轉(zhuǎn)基因檢測實驗室的污染問題。種子轉(zhuǎn)基因檢測實驗室總體布局和各工作區(qū)域的安排，是以減少其潛在的對樣本的污染、獲得可靠的檢測結(jié)果和減輕對人員的危害為目的，可采取必要的物理隔離、增加可控空氣流向的通風(fēng)設(shè)備及相對獨立的區(qū)域等有效措施，降低交叉污染、實驗室中其他樣品和擴(kuò)增材料產(chǎn)生的殘留物污染以及試劑和樣品所引起的假陽性結(jié)果等風(fēng)險。

      一般來說，種子轉(zhuǎn)基因檢測實驗室布局可按照分子生物學(xué)實驗室的要求設(shè)計，根據(jù)種子轉(zhuǎn)基因檢測的特點，按照核酸污染程度，可劃分為試劑配制區(qū)、樣品制備區(qū)、前PCR區(qū)和PCR區(qū)4個獨立的功能區(qū)域（圖1）。每個分隔區(qū)獨立使用實驗室設(shè)備，開展相應(yīng)實驗，將能有效消除或降低實驗污染的機(jī)會。

      2.1.1 試劑配制區(qū)

      用于檢測中所有試劑的存儲、配制和分裝，包括PCR反應(yīng)體系預(yù)混液的配制與分裝。該區(qū)域與實驗室的其他區(qū)域間必須存在完全的物理隔離，使正?？諝饬飨虿荒軄碜杂跇悠窚?zhǔn)備區(qū)域、產(chǎn)物分析區(qū)域。檢測的樣品不能帶入該區(qū)域。如果不能做到正壓，試劑的配制操作必須在該區(qū)域?qū)Ｓ玫纳锇踩窕虺瑑艄ぷ髋_中進(jìn)行。

      2.1.2 樣品制備區(qū)

      用于樣品的準(zhǔn)備、前處理。該區(qū)域正?？諝饬鲃硬荒軄碜杂谇癙CR區(qū)、PCR區(qū)。樣品準(zhǔn)備區(qū)域內(nèi)部的排氣系統(tǒng)可以排除任何來源于空氣中的污染物，其排出的氣流不能污染到其他幾個區(qū)域。任何和樣品接觸的儀器和設(shè)備應(yīng)該進(jìn)行清洗、消毒。

      2.1.3 前PCR區(qū)

      用于核酸提取純化、儲存和在PCR反應(yīng)體系加入DNA模板。該區(qū)域要和樣品制備區(qū)、試劑配制區(qū)、PCR區(qū)分開；該區(qū)域的正?？諝饬鲃硬荒軄碜杂跇悠分苽鋮^(qū)、PCR區(qū)；該區(qū)域排出的氣流不能流向樣品制備區(qū)、試劑配制區(qū)；該區(qū)域中的正?？諝鈶?yīng)該使用正壓，使空氣流向區(qū)域外部，以避免來自樣品的交叉污染。如果該區(qū)域是完全與PCR區(qū)隔離，并且和樣品制備區(qū)及試劑配制區(qū)沒有空氣交換，那么這個區(qū)域的正壓也可以不用設(shè)置。

      2.1.4 PCR區(qū)域

      用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)和擴(kuò)增產(chǎn)物分析。該區(qū)必須和其他3個區(qū)域進(jìn)行完全的物理隔離；該區(qū)應(yīng)具備負(fù)壓或單向排風(fēng)條件或設(shè)置生物安全柜，使空氣流向區(qū)域內(nèi)部，或者進(jìn)行內(nèi)部循環(huán)，而不能流向試劑配制區(qū)和樣品制備區(qū)。

       2.2   減少實驗步驟

      種子轉(zhuǎn)基因檢測一般分為樣品流轉(zhuǎn)、粉碎研磨、核酸提取、配置體系、擴(kuò)增電泳等操作，每一步操作都可能會產(chǎn)生樣品間污染，減少操作步驟能夠有效減少污染。其中實時熒光PCR（TaqMan技術(shù)）能夠?qū)崟r觀測檢測結(jié)果，有效減少污染發(fā)生。

      一般PCR檢測由核酸提取、PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳3個步驟組成。實時熒光PCR（TaqMan技術(shù)）是在一般PCR基礎(chǔ)上，添加1條標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)（一般是FAM和TAMRA）的探針，能夠在PCR擴(kuò)增過程中通過記錄熒光信號強(qiáng)度對擴(kuò)增產(chǎn)物的積累進(jìn)行實時監(jiān)控，從而在擴(kuò)增結(jié)束時對結(jié)果進(jìn)行判斷。以實時熒光PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的種子轉(zhuǎn)基因成分檢測可將檢測步驟縮短為兩步，即核酸提取和PCR擴(kuò)增，提高檢測效率，節(jié)約時間成本。實時熒光PCR檢測則采用完全閉管檢測，無需PCR開蓋后處理，避免了交叉污染和假陽性的風(fēng)險，能夠有效防止PCR產(chǎn)物污染。

       2.3   使用高質(zhì)量試劑

      使用高質(zhì)量試劑能夠有效降低試劑污染。首先，應(yīng)對購買的試劑進(jìn)行質(zhì)量測試，避免試劑本身攜帶可檢出的靶標(biāo)，比如NPTII基因的核酸片段。其次，應(yīng)對大包裝試劑進(jìn)行分裝，避免試劑反復(fù)凍融，防止反復(fù)使用試劑，造成試劑污染。第三，應(yīng)定期檢測保存的試劑，對變質(zhì)試劑和過期試劑及時清理，如遇試劑污染，應(yīng)盡快檢查和處理。

       2.4   設(shè)置對照

      設(shè)置對照能夠很快發(fā)現(xiàn)結(jié)果是否準(zhǔn)確以及是否存在污染的情況。種子轉(zhuǎn)基因成分檢測采用的對照包括空白對照、陰性樣品對照和陽性樣品對照?？瞻讓φ瞻ㄔ噭┛瞻讓φ蘸吞崛】瞻讓φ?。試劑空白對照是在PCR反應(yīng)體系中用相同體積的水代替模板DNA，用于驗證PCR反應(yīng)過程中沒有污染。提取空白對照是在DNA提取過程中，用水代替測試樣品完成提取的所有步驟，用以驗證提取過程沒有核酸污染。在同時對多個測試樣品提取DNA并進(jìn)行PCR分析時，設(shè)置提取空白對照是十分必要的。陰性樣品對照是從可溯源的陰性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中提取的不含外源目標(biāo)核酸序列的DNA，用于驗證測試樣品中是否含有該物種特異性基因（內(nèi)標(biāo)基因）以及反應(yīng)體系是否受到陽性污染。陽性樣品對照是從可溯源的陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中提取的DNA或從含有已知序列陽性樣品中提取的DNA，用于驗證測試樣品的檢測過程是否能檢測出陽性片段。陽性對照的轉(zhuǎn)基因成分含量根據(jù)檢測方法的檢出限設(shè)置，如檢出限為0.1%的檢測方法，應(yīng)選用轉(zhuǎn)基因含量為0.1%的樣品作為陽性對照。利用這些對照的檢測結(jié)果，可對檢測過程和檢測結(jié)果進(jìn)行分析和報告（表2）。

       2.5   質(zhì)量控制計劃

      為確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，種子轉(zhuǎn)基因成分檢測可采用儀器比對、人員比對、方法比對、樣品復(fù)測等方法對檢測結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，防止污染。制定種子轉(zhuǎn)基因成分檢測結(jié)果質(zhì)量控制計劃，定期采用以上方法對結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，發(fā)現(xiàn)污染情況及時處理。如果污染問題常發(fā)，可適當(dāng)增加質(zhì)量控制的實施次數(shù)。

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      種子轉(zhuǎn)基因檢測實驗室污染應(yīng)對策略

      實驗室污染會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，即本應(yīng)是陰性的樣品擴(kuò)增出目的條帶?？赡艿脑蚴菢悠烽g交叉污染、PCR試劑的污染、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染、環(huán)境的氣溶膠污染等情況。出現(xiàn)這種情況時，應(yīng)考慮所用試劑及操作的每一步出現(xiàn)DNA污染的可能性，逐一分析，排除污染。

       3.1   個別樣品污染的原因分析及應(yīng)對策略

      如果同一批次檢測的樣品只有個別樣品出現(xiàn)污染情況，則很可能是樣品間交叉污染，尤其是該批樣品中有陽性樣品時。這時應(yīng)將該樣品重新進(jìn)行單獨檢測，并在檢測中設(shè)置提取對照、陰性對照和陽性對照，檢測過程中盡量避免與其他樣品接觸。如果仍有污染，則考慮試劑污染，重新?lián)QDNA提取試劑后重復(fù)檢驗。

       3.2   大量樣品污染的原因分析及應(yīng)對策略

      如果同一批次或不同批次檢測的樣品都出現(xiàn)污染情況，且是多檢測元件污染，則考慮是試劑污染或PCR產(chǎn)物污染。試劑污染可能是在操作過程中有產(chǎn)物或者陽性核酸混入了試劑中，這時陰性對照也呈現(xiàn)陽性，需要更換試劑重新實驗。PCR產(chǎn)物污染影響比較嚴(yán)重，需要對環(huán)境進(jìn)行清理，整個實驗室可進(jìn)行核酸酶噴灑、紫外線照射消毒、實驗儀器高溫滅菌等操作。整個實驗室處理完成后需要通風(fēng)，如有必要，可在通風(fēng)處進(jìn)行臨時實驗。

       3.3   某一檢測元件污染的原因分析及應(yīng)對策略

      種子轉(zhuǎn)基因檢測中很可能出現(xiàn)某一檢測元件污染，而其他元件正常的情況。這可能是因為核酸擴(kuò)增酶中自帶檢測目標(biāo)核酸序列，比如NPTII基因的核酸片段。擴(kuò)增酶中含有該核酸片段，會導(dǎo)致每個擴(kuò)增反應(yīng)包括陰性對照，都會顯示為陽性“檢出”，這就是實驗室遇到的“水中都可以檢出轉(zhuǎn)基因成分”問題，如圖2所示。這種情況下需要更換使用的擴(kuò)增體系，對新使用的體系進(jìn)行測試，以確保新體系中沒有NPTII基因的核酸片段。

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      討論

      種子轉(zhuǎn)基因檢測實驗室的污染主要來源于樣品間污染、PCR產(chǎn)物污染和試劑污染。防止種子轉(zhuǎn)基因檢測實驗室污染的方法主要依靠合理的實驗室布局、減少實驗步驟、使用高質(zhì)量試劑、設(shè)置對照和制定合理的質(zhì)量控制計劃來防控。對于污染的種子轉(zhuǎn)基因檢測實驗室，應(yīng)該分析具體原因，對實驗試劑、實驗樣品、實驗環(huán)境等進(jìn)行逐一分析，確定污染源，消除污染因素后繼續(xù)實驗。

      一個合格的種子轉(zhuǎn)基因檢測實驗室，不僅要有先進(jìn)的檢測技術(shù)能力，還應(yīng)按照轉(zhuǎn)基因成分檢測的特點，制定合理的防污染措施，以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。隨著我國轉(zhuǎn)基因政策的不斷放寬，轉(zhuǎn)基因種子將很快進(jìn)入審定和種植環(huán)節(jié)，這對于種子轉(zhuǎn)基因檢測來說是巨大的挑戰(zhàn)。做好種子轉(zhuǎn)基因檢測實驗室污染防控將更加重要。（參考文獻(xiàn)略）

      ?本文來自《種子轉(zhuǎn)基因檢測實驗室污染原因排查和分析應(yīng)對》

      ?作者：雷軍,茍飛凡,張海波

      ?單位：陜西省種子工作總站；陜西禮泉甘河國家濕地公園管理處

      ?刊于《中國種業(yè)》2023年第7期26-30頁 轉(zhuǎn)載請注明