在新時(shí)代對(duì)基因編輯作物商業(yè)化的展望與思考（上）、新時(shí)代對(duì)基因編輯作物商業(yè)化的展望與思考（中）（←點(diǎn)擊可查看全文）兩期文章中，筆者談及了基因編輯在作物改良上的發(fā)展前景及已取得的豐碩成果。那么如果想要進(jìn)行基因編輯育種，如何制定方案以及需要準(zhǔn)備多大的投入呢？

      1基因編輯育種方案主要涉及的三方面內(nèi)容

       1.1   待改良材料與目標(biāo)性狀的選擇

      新時(shí)代對(duì)基因編輯作物商業(yè)化的展望與思考（中）（←點(diǎn)擊可查看全文）已經(jīng)舉例了不少基因編輯可以改良的性狀。

      基因編輯育種方案的確定，應(yīng)以待改良材料為切入點(diǎn)，而并非某個(gè)預(yù)設(shè)的靶點(diǎn)或性狀。

      因?yàn)榇蠹冶仨毭鞔_一點(diǎn)，基因編輯是對(duì)一個(gè)或幾個(gè)位點(diǎn)的定向改造。而一個(gè)成功的品種是由一系列的優(yōu)良性狀共同決定的，因此，僅靠基因編輯一兩個(gè)位點(diǎn)無法產(chǎn)生一個(gè)優(yōu)良的品種。

      基因編輯在育種中的定位應(yīng)該是補(bǔ)齊短板或創(chuàng)造特色！

      舉個(gè)例子，一個(gè)玉米品種產(chǎn)量等方面表現(xiàn)非常好，但是在區(qū)域試驗(yàn)中，出現(xiàn)了某地點(diǎn)高感穗粒腐病，因此被一票否決。那么通過基因編輯突變特定感病基因位點(diǎn)，使品種達(dá)到中抗以上的水平，從而順利通過省審乃至國審，是有可行性的。

      又比如，一個(gè)油菜品種各性狀的綜合表現(xiàn)不錯(cuò)。但是缺少特色，推廣受阻。通過基因編輯降低芥酸含量，編輯改良的油菜品種憑借低芥酸油菜或菜籽油的賣點(diǎn)，就容易被大家認(rèn)可和接受。

      然而對(duì)缺陷較多的材料開展基因編輯，能起到的改良效果有限。基因編輯只能進(jìn)行定向改造，并不能挽救一個(gè)失敗的品種。

      好的編輯靶點(diǎn)應(yīng)用于改良一個(gè)好的品種，才能創(chuàng)造爆款品種！

       1.2   基因編輯載體的設(shè)計(jì)

      一般來說，相關(guān)的生物或農(nóng)業(yè)科技公司，都已經(jīng)有成熟的基因編輯載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化及篩選的技術(shù)。在這方面，育種家不需要糾結(jié)于具體的技術(shù)細(xì)節(jié)。

      需要強(qiáng)調(diào)的是，現(xiàn)在的基因編輯技術(shù)，是允許同時(shí)針對(duì)多個(gè)靶基因進(jìn)行編輯的！

      因?yàn)镃RISPR/Cas9技術(shù)是Cas9蛋白通過gRNA靶向目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行切割的。因此在載體上同時(shí)設(shè)計(jì)靶向多個(gè)位點(diǎn)的gRNA，即可以達(dá)到一個(gè)載體完成多基因突變的目的。

      強(qiáng)烈建議育種家在進(jìn)行基因編輯試驗(yàn)的時(shí)候，考慮多個(gè)靶點(diǎn)。

      同時(shí)編輯多個(gè)靶點(diǎn)并不會(huì)大幅度提升成本，但是卻可以大大節(jié)省育種時(shí)間，何樂而不為呢？不要擔(dān)心同時(shí)編輯多個(gè)靶點(diǎn)會(huì)畫蛇添足產(chǎn)生不良的結(jié)果。要知道即便是同時(shí)改良3個(gè)位點(diǎn)，我們也可以輕易地通過與野生型雜交，分離出單個(gè)位點(diǎn)改良的材料，以滿足不同的育種需求。

      最近在番茄育種上就有一個(gè)非常典型的例子。中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所李傳友研究組同時(shí)編輯3個(gè)番茄顏色相關(guān)的基因，得到綠色的番茄。在此基礎(chǔ)上將其與紅色野生型雜交并分離篩選，分別獲得了3種單基因突變（橙色、粉紅色、棕色）、3種雙基因突變（黃色、紅紫色、黃綠色），共計(jì)6種顏色的番茄種質(zhì)。這些材料除了顏色的差別外，在單果重、單株產(chǎn)量、果實(shí)可溶性固形物含量和維生素C含量等性狀上均不存在顯著差別（Yang et al., 2022）。

      有育種家會(huì)認(rèn)為，目標(biāo)性狀目前只有一個(gè)關(guān)鍵基因，不需要進(jìn)行多基因編輯。即使主體目標(biāo)是確定的，但并不是不能同時(shí)改良或嘗試改變其他性狀！

      比如說，某育種家希望將一種糯玉米改良出類似水稻的香味。上期我們談到過，通過單基因編輯令玉米積累2-AP就可以達(dá)到這個(gè)目的。

      此外，還可以同時(shí)提高穗粒腐病抗性！

      還可以嘗試同時(shí)敲除Sh2基因創(chuàng)造超甜的香玉米種質(zhì)！

      還可以分離出超甜香自交系與糯香自交系雜交生成Shshwxwx基因型的香甜糯玉米雜交種！

      通過以上設(shè)計(jì)可以同時(shí)得到攜帶香味的糯玉米、甜玉米以及甜糯玉米，同時(shí)這些玉米的穗粒腐病抗性還能得到提高。

通過一次基因編輯產(chǎn)生7種不同顏色的西紅柿（Yang et al., 2022）

       1.3   遺傳轉(zhuǎn)化受基因型限制的作物改良方案

      大多數(shù)主要作物的遺傳轉(zhuǎn)化目前受到基因型的限制，即盡管很多作物已經(jīng)有了轉(zhuǎn)基因體系，但不是所有品種都可以輕松地進(jìn)行轉(zhuǎn)基因?；蚓庉嬘N通過轉(zhuǎn)基因引入Cas9及gRNA，育種家想要改良的特定品種受這種限制無法直接編輯。商業(yè)化的生物技術(shù)公司往往只提供對(duì)特定種質(zhì)的轉(zhuǎn)基因服務(wù)。再通過回交和分子標(biāo)記檢測，將靶基因突變導(dǎo)入特定品種中。

      筆者建議，在基因編輯的T0代（世代1），即雜合世代，就開始與待改良的自交系進(jìn)行雜交，雜交F?（世代2）中將會(huì)有1/4的材料攜帶雜合變異基因型且分離掉了外源載體序列（假設(shè)只改良單一位點(diǎn)）。接著通過3代與待改良材料的回交，獲得BC?F?（世代5）的材料，其中每代都會(huì)有1/2的材料攜帶雜合的變異基因型。最后通過1代自交，獲得的BC?F?（世代6）中有1/4攜帶純合變異基因型的自交系，該改良自交系可以表現(xiàn)目標(biāo)性狀，且理論背景恢復(fù)率達(dá)到了90%以上，可以作為新品種或新品種的親本進(jìn)行使用。

      按以上的技術(shù)流程，共計(jì)花費(fèi)6個(gè)世代的時(shí)間，對(duì)大多數(shù)作物來說，意味著3年左右的育種周期。

      注意，因?yàn)榛蚓庉媱?chuàng)造的基因型，大多數(shù)是隱性突變基因型，因此利用雜種優(yōu)勢的作物，需要同時(shí)對(duì)品種的雙親進(jìn)行改良。還要需要注意回交過程對(duì)配合力的影響，建議利用芯片等技術(shù)監(jiān)控遺傳背景，使改良后的材料與原本的親本盡量相近。同時(shí)，建議對(duì)雙親的改良使用不同遺傳背景的基因編輯材料作為供體親本，以保證導(dǎo)入的目標(biāo)片段仍保留一定程度的雜種優(yōu)勢。

      也有科學(xué)家提出繞過遺傳轉(zhuǎn)化基因型限制，一步到位地進(jìn)行特定材料基因編輯的技術(shù)設(shè)想，如單倍體誘導(dǎo)基因編輯、嫁接介導(dǎo)基因編輯等。但由于編輯效率等諸多問題，暫時(shí)未能邁過商業(yè)化的門檻。不再一一贅述，希望相關(guān)的技術(shù)可以盡快得到改良并走向商用。

基因編輯改良特定品種的技術(shù)流程（括號(hào)中標(biāo)注種植世代）

      2基因編輯育種的成本核算

      在明確了基因編輯作物改良方案基礎(chǔ)上，就可以進(jìn)行成本核算。

      由于基因編輯是一種定向設(shè)計(jì)育種技術(shù)，性狀表現(xiàn)可以預(yù)期，只有最終成功與否，不需要“萬里挑一”的表型選擇。所以，表型鑒定和選擇這一傳統(tǒng)育種的重要支出項(xiàng)上，基因編輯育種的成本幾乎可以忽略。

      基因編輯育種的成本主要有哪些呢？

      1）基因編輯本身的成本：指載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化、獲得T0植株或者種子等工作中涉及的成本。

      2）后代基因型鑒定的成本：在后代中選擇攜帶變異基因型、不攜帶載體序列的植株，這個(gè)過程中基因型檢測的成本，此外還包括回交中追蹤變異基因型及檢測遺傳背景的成本。

      3）育種過程中的土地和人力成本：基因編輯育種，需要保證目標(biāo)位點(diǎn)有足夠的分離材料即可，每代有數(shù)百棵植株便可以富余地滿足試驗(yàn)需求。土地及人力成本，相對(duì)于前兩項(xiàng)成本來說非常有限。

      明確這些成本來源后，我們可以很容易對(duì)基因編輯育種的成本進(jìn)行核算。

      對(duì)于基因編輯本身的成本來說，如果完全交給生物或農(nóng)業(yè)科技公司進(jìn)行，大多數(shù)作物的多位點(diǎn)基因編輯價(jià)格不會(huì)超過3萬元。

      基因型鑒定，若只鑒定一代，成本并不高；若對(duì)雜交、連續(xù)回交和自交后代進(jìn)行基因型檢測，成本相當(dāng)于分子標(biāo)記輔助回交育種。以公司商業(yè)化分子標(biāo)記輔助育種項(xiàng)目收費(fèi)為參考，一個(gè)材料的價(jià)格不會(huì)超過5萬元（不進(jìn)行背景檢測）。

      對(duì)于基因型不受限的作物，基因編輯育種的成本=基因編輯本身成本（3萬）+少基因型檢測成本+少量土地及人力成本，原則上可以控制在5萬元以內(nèi)。

      對(duì)于基因型受限的作物，只使用一個(gè)基因編輯材料作為供體，不檢測背景恢復(fù)率的情況下，基因編輯育種的成本≈基因編輯本身成本（3萬）+分子標(biāo)記輔助回交育種成本（5萬）+少量土地及人力成本，基本可以控制在10萬以內(nèi)。當(dāng)然如果需要對(duì)雙親同時(shí)改良，并且考慮對(duì)雜種優(yōu)勢影響的情況下，成本可能會(huì)進(jìn)一步上升，但應(yīng)該不會(huì)超過20萬。

      以上是基于公司商業(yè)化基因編輯及分子標(biāo)記輔助選擇服務(wù)的成本估算。如果育種家或機(jī)構(gòu)自己可以完成其中一部分環(huán)節(jié)，成本還可以進(jìn)一步壓縮。

      新時(shí)代下對(duì)基因編輯作物商業(yè)化的展望及思考，到此分享完畢。不知道屏幕前您認(rèn)為，基因編輯育種時(shí)機(jī)是否成熟了？

      如果大家對(duì)基因編輯育種仍有興趣的話，筆者將從個(gè)人角度解讀一下《農(nóng)業(yè)用基因編輯植物安全評(píng)價(jià)指南（試行）》。各位同仁，有緣再見。

      參考文獻(xiàn)

      Tianxia Yang, Muhammad Ali, Lihao Lin, Ping Li, Hongju He, Qiang Zhu, Chuanlong Sun, Ning Wu, Xiaofei Zhang, Tingting Huang, Chang-Bao Li, Chuanyou Li, Lei Deng. Recoloring tomato fruit by CRISPR/Cas9-mediated multiplex gene editing. Horticulture Research[J]. 2022, 8: uhac214.

      作者：杭州墨育

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