以下文章來源于南北學(xué)苑 ，作者鐘舒陽

      性狀整合（Trait Integration）通俗的說法就是性狀回交轉(zhuǎn)育，即使用待整合的常規(guī)自交系（做母本）與攜帶轉(zhuǎn)基因性狀的自交系（做父本）進(jìn)行一次雜交；再使用常規(guī)自交系作為輪回親本（受體），進(jìn)行多次回交，從中篩選出既攜帶轉(zhuǎn)基因性狀，且DNA指紋和DUS表型與原常規(guī)自交系相同的家系；最后通過自交獲得轉(zhuǎn)基因性狀純合的自交系，用于下一步擴(kuò)繁和制種。

      一、DBNBC的性狀整合

      1.1 性狀整合的注意事項(xiàng)

      DBNBC目前擁有三款轉(zhuǎn)基因性狀產(chǎn)品，分別是?？?reg;（DBN9936）、倍抗®（DBN 3601T）和庇護(hù)所（DBN9958），其中?？?reg;和倍抗®同時具有各自的靶標(biāo)害蟲抗性和除草劑耐受性，庇護(hù)所具有草甘膦和草銨膦的除草劑耐受性。

      目前，DBNBC既提供回交轉(zhuǎn)育服務(wù)，也鼓勵育種單位自行回交轉(zhuǎn)育。下面就回交轉(zhuǎn)育過程和完成后的注意事項(xiàng)，列出6點(diǎn)：

      確保受體自交系的質(zhì)量。根據(jù)《國家級轉(zhuǎn)基因玉米品種審定標(biāo)準(zhǔn)（試行）》的要求，轉(zhuǎn)基因品種的受體品種已通過審定，除轉(zhuǎn)化體導(dǎo)入所致位點(diǎn)差異外，轉(zhuǎn)基因品種與受體品種的DNA指紋檢測差異位點(diǎn)數(shù)＜ 2個。因此，DBNBC會請第三方權(quán)威機(jī)構(gòu)對計(jì)劃回交轉(zhuǎn)育的自交系進(jìn)行DNA指紋檢測，如果新自交系存在2個及以上的SSR雜合位點(diǎn)，會使用一套種子替換流程，在回交轉(zhuǎn)育進(jìn)度和交付材料的DNA指紋達(dá)標(biāo)之間尋找平衡。在此，也提醒各合作單位，盡量在完成自交系的純化后再提交種子，并且避免使用與非轉(zhuǎn)基因品種的制種親本來源不同的穗行。

      將抗蟲和耐除草劑性狀盡可能整合到母本中。一方面，?？?reg;和倍抗®具有抗蟲的轉(zhuǎn)基因性狀，所以DBNBC建議將轉(zhuǎn)基因性狀整合到育種單位的母本自交系中，降低制種成本，減少制種時的產(chǎn)量損失。另一方面，母本具有除草劑耐受性，在制雜交種的過程中，一旦出現(xiàn)母本去雄不徹底而自交的情況，也能保證混在雜交種中的自交種子攜帶轉(zhuǎn)基因性狀，避免在播種并噴施靶標(biāo)除草劑后，出現(xiàn)死苗。

      轉(zhuǎn)育過程中，加強(qiáng)質(zhì)量管理。在每一世代，DBNBC都采取靶標(biāo)除草劑噴施和分子檢測（目標(biāo)轉(zhuǎn)化體基因型和非目標(biāo)轉(zhuǎn)基因污染）相結(jié)合的質(zhì)控措施，并嚴(yán)格遵守一套授粉原則。育種單位自行回交時，如無分子檢測條件，一定要規(guī)范靶標(biāo)除草劑的使用，保證剔除全部陰性苗。

      轉(zhuǎn)育過程中，充分運(yùn)用分子篩選和表型鑒定，確保轉(zhuǎn)育質(zhì)量和效率。DBNBC采取分子篩選和DUS表型篩選相結(jié)合的策略，加快材料交付。分子篩選包括使用SNP進(jìn)行背景選擇，使用SSR指紋（《GB/T 39914—2021 主要農(nóng)作物品種真實(shí)性和純度SSR 分子 標(biāo)記檢測 玉米》）進(jìn)行篩選。DUS表型篩選覆蓋39個玉米基本性狀（《GB/T 19557.24-2018 植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南 玉米》），測試方法與指南保持一致。育種單位自行回交時，可以根據(jù)自己的需求，靈活調(diào)整篩選策略和群體量。

      轉(zhuǎn)育完成后，注重版本選擇。目前，DBNBC交付多個不同穗行來源的果穗，建議合作單位在完成配合力測試和抗性鑒定后，篩選出最優(yōu)穗行，再以該穗行進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)繁和制種，并且在擴(kuò)繁過程中，遵循原種使用規(guī)則，避免自交衰退。

      根據(jù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)展，建議大家在選育出新自交系，并且純化穩(wěn)定后，及時開展轉(zhuǎn)基因性狀的回交轉(zhuǎn)育，并用完成轉(zhuǎn)基因回交轉(zhuǎn)育的材料組配新組合參試。

      1.2 性狀整合的2個風(fēng)險點(diǎn)

      目前，DBNBC的性狀整合策略已經(jīng)基本成熟，但是在試驗(yàn)過程中時常遇到兩點(diǎn)風(fēng)險。第1個風(fēng)險點(diǎn)是SNP結(jié)果與SSR指紋不能完全對應(yīng)，其中又細(xì)分成兩種情況，一是當(dāng)材料回交完成時，根據(jù)SNP數(shù)據(jù)計(jì)算的背景回復(fù)率已經(jīng)超過97%，甚至達(dá)到99%，但是SSR指紋與原始常規(guī)自交系仍然具有2~4個的差異位點(diǎn)；二是SSR指紋中的缺失值測定并不穩(wěn)定，導(dǎo)致無法準(zhǔn)確判斷供體和受體之間的初始SSR差異位點(diǎn)數(shù)，以及完成性狀整合的轉(zhuǎn)基因材料是否達(dá)標(biāo)（差異位點(diǎn)數(shù)< 2個）。針對這一風(fēng)險點(diǎn)，DBNBC目前采用SNP和SSR指紋檢測并行，并重復(fù)驗(yàn)證的篩選策略，保證不影響性狀整合的進(jìn)程和育種單位的品種審定。

      但是，從生物學(xué)意義上討論，SSR指紋相對SNP具有更豐富的多態(tài)性，而DBNBC用于篩選的SNP數(shù)量超過SSR指紋的2個數(shù)量級，對于SNP背景回復(fù)率已經(jīng)超過97%的轉(zhuǎn)基因材料，如果存在2個SSR差異位點(diǎn)，轉(zhuǎn)基因材料和常規(guī)受體材料是否是同一份材料？進(jìn)一步，如果轉(zhuǎn)基因材料和常規(guī)受體材料同時在39個DUS表型上沒有明顯差異，是否能算做同一份材料？

      第2個風(fēng)險點(diǎn)是熱源血緣材料在高緯度地區(qū)（長日照條件）的花期不遇，授粉困難。由于熱源材料在抗性等表型上具有優(yōu)勢，育種家目前已經(jīng)選育出很多攜帶熱源血緣的優(yōu)良自交系，但是，伴隨連鎖累贅等因素，部分熱源血緣材料在高緯度地區(qū)花期延長，ASI過大，導(dǎo)致花期不遇，授粉困難。目前，DBNBC通過提前與合作單位溝通，獲得材料花期/生育期信息，對熱源血緣材料增加錯期，調(diào)節(jié)光周期等手段，可以適當(dāng)規(guī)避風(fēng)險，保持性狀整合的試驗(yàn)進(jìn)程連續(xù)進(jìn)行。在此，向各位老師請教，是否有簡單便捷的操作，可以實(shí)現(xiàn)熱源血緣材料在高緯度地區(qū)的正常生長？

      1.3 性狀整合的1種可能性

      當(dāng)前，轉(zhuǎn)基因性狀整合手段以回交、前景（轉(zhuǎn)基因性狀）篩選和背景篩選為核心，整體周期偏長，并且針對轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)附近的連鎖累贅篩選（LDS）投入較高。隨著基因編輯技術(shù)的日新月異，特別是大片段定向插入技術(shù)的發(fā)展，有可能完全顛覆現(xiàn)有的性狀整合手段——將獲得安全證書的轉(zhuǎn)化體片段定向插入常規(guī)自交系的指定位置，快速完成性狀整合，并完全規(guī)避連鎖累贅的風(fēng)險。

      二、轉(zhuǎn)基因材料大規(guī)模繁制種時的目標(biāo)轉(zhuǎn)化事件純度和非目標(biāo)轉(zhuǎn)基因成分污染檢測的討論

      目前，無論是自交系還是雜交種，轉(zhuǎn)基因玉米材料純度的國家標(biāo)準(zhǔn)尚未確定。常規(guī)玉米材料對自交系的純度要求是原種99.9%，大田用種99%，對單交種的純度要求是大田用種96%（《GB 4404.1-2008 糧食作物種子 第1部分 禾谷類》）。如果轉(zhuǎn)基因玉米市場開放，無論常規(guī)或轉(zhuǎn)基因玉米材料，非目標(biāo)轉(zhuǎn)基因成分污染肯定會納入監(jiān)管，需要檢測的轉(zhuǎn)化體數(shù)量也會超過現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)（《GB/T 19495.4-2018 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測 實(shí)時熒光定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測方法》，《GB/T 38505-2020轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品通用檢測方法》）。相對于常規(guī)材料，轉(zhuǎn)基因材料增加了目標(biāo)轉(zhuǎn)化事件的純度檢測一項(xiàng)。目前，DBNBC采納國際種子檢驗(yàn)協(xié)會（ISTA）的多篇文獻(xiàn)，對目標(biāo)轉(zhuǎn)化事件的純度和非目標(biāo)轉(zhuǎn)基因污染的檢測設(shè)置了超過常規(guī)材料國家標(biāo)準(zhǔn)的高閾值，對使用DBNBC轉(zhuǎn)基因性狀的玉米品種進(jìn)行嚴(yán)格把關(guān)。

      在轉(zhuǎn)基因玉米材料純度的國家標(biāo)準(zhǔn)頒布之前，對合作單位有2點(diǎn)建議，一是在缺少分子檢測輔助的情況下，規(guī)范除草劑的使用，加強(qiáng)對目標(biāo)轉(zhuǎn)化事件陰性苗的剔除，二是加強(qiáng)繁制種基地的隔離，最大程度避免非目標(biāo)轉(zhuǎn)基因成分污染。無論是陰性苗還是非目標(biāo)轉(zhuǎn)基因污染，一旦收獲并混合使用在同一批次的轉(zhuǎn)基因種子中，種植之后再檢測、剔苗等的成本是巨大的。

      三、入職體會

      入職DBNBC以來，逐漸深刻意識到轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)業(yè)化是一個系統(tǒng)工程。在公司內(nèi)部，轉(zhuǎn)基因性狀整合只是整個環(huán)節(jié)的最后一步，現(xiàn)在可供育種單位進(jìn)行性狀整合的三款轉(zhuǎn)基因性狀產(chǎn)品的前期研發(fā)和評估道路是艱辛和曲折的，十年磨一劍，這三款產(chǎn)品的抗性水平是扎實(shí)且穩(wěn)定的。

      另外和博士期間的基礎(chǔ)研究不同，在學(xué)校，個人完全掌握課題進(jìn)度，需要對接的人比較少，通常是導(dǎo)師和幾位同課題的同學(xué)，有更高的容錯率，允許經(jīng)常性的臨時調(diào)整，但是在公司，一是以目標(biāo)為導(dǎo)向，盡量減少摸索性質(zhì)的工作，充分討論試驗(yàn)方案的可行性，充分考慮資源花費(fèi)；二是涉及多個平臺間的合作，試驗(yàn)計(jì)劃要提前完成并做好溝通，每一代的試驗(yàn)進(jìn)度要跟緊。

      以上，簡要介紹了DBNBC的轉(zhuǎn)基因性狀整合工作和幾點(diǎn)思考體會，前面還有很多東西要學(xué)，有很多路要走，歡迎各位老師對文中內(nèi)容進(jìn)行指導(dǎo)和建議。