以下文章來源于一麥眾承 ，作者倪永靜

 

      作者簡介：

 

      1創(chuàng)建小麥突變體庫

 

      選用均勻一致的國麥301種子1kg，首先在冷水中浸泡4小時，然后用0.4%（v/v）EMS溶液在0℃處理種子2小時，接著在20℃處理14小時。排干EMS溶液，在流水中沖洗4個小時，晾干后種植于商丘市農林科學院雙八試驗基地。M?代種子于2012年10月單粒播種，行距0.23m，株距0.08m，按單穗收獲（即M?種子）；M?種子于2013年10月種穗行，行距0.23m，株距0.08m。M?、M?均以未處理的國麥301為對照。田間管理按一般試驗田進行。

 

      每7~10d田間調查一次，觀察記載幼苗、葉形、莖、分蘗、穗部、育性等性狀，篩選各種表型突變體。變異穗系全部單株收獲脫粒后，觀察記載籽粒形狀、大小、顏色等性狀。

 

      對M? 12020個穗系的主要農藝性狀及其他生物學性狀進行調查，共獲得769個突變體系。其中，5個苗期致死、109個株高突變、177個葉片性狀突變（幼苗期、成株期）、82個穗部性狀突變、18個成熟期發(fā)生突變，64個分蘗突變，45個不育突變，52個籽粒突變，217個其他性狀的突變。M?中發(fā)生表型突變的頻率約為6.398%。具體突變類型如表1，部分突變體類型展示如圖1。

 

 

 

圖1部分突變體類型

 

      2 矮化獨稈突變體dmc的生物學特征及遺傳分析

 

      ?2.1獨稈突變體的獲得及其生物學特征

 

      通過連續(xù)單株選擇，獲得了1個不分蘗突變體dmc純合株系。該突變體完全不分蘗，只有一個主莖（圖2-A），個別植株偶爾會有1個小分蘗。2016-2017年大田突變體株系dmc平均分蘗1.11個，突變親本國麥301平均分蘗21.73個。突變體dmc植株明顯矮小，株高48.00cm，是突變親本國麥301的74.53%（圖2-A）。進一步對比發(fā)現(xiàn)，突變體dmc只有4個節(jié)間，比國麥301少了一個節(jié)間，與突變親本國麥301相比，突變體dmc各節(jié)間長度（倒Ⅰ-倒Ⅳ）均縮短（圖2-F）；而且突變體dmc倒Ⅰ節(jié)間的直徑比國麥301要小（圖2-E）。

 

  圖2 突變體dmc和國麥301主要農藝性狀比較

      A: 抽穗期突變體dmc（右）與國麥301（左）植株對比，B: 突變體dmc（右）和國麥301（左）穗部對比，C: 灌漿期突變體dmc（右）和國麥301（左）籽粒對比，D: 蠟熟期突變體dmc（右）和國麥301（左）籽粒對比，E: 突變體dmc（下）和國麥301（上）倒1節(jié)間直徑對比，F(xiàn): 突變體dmc（右）和國麥301（左）節(jié)間對比。

 

      ?2.2 遺傳背景檢測

 

      利用 SSR標記對突變親本國麥301與突變體dmc的遺傳背景進行檢測比較，結果顯示分布在42條染色體上的431個SSR標記擴增位點均沒有發(fā)現(xiàn)差異性條帶，表明突變親本國麥301與dmc的遺傳背景高度一致。這個結果證明突變體dmc是由國麥301誘變而來的。

 

 

M: 分子量標準（DL100）；泳道1-3：國麥301，泳道4-6：突變體dmc，擴增產物條帶下是SSR引物名稱

 

圖3 SSR標記檢測

 

      ?2.3 國麥301和突變體dmc的組織學觀察

 

      通過比較不分蘗突變體dmc和野生型對照國麥301的分蘗形態(tài)和顯微結構，發(fā)現(xiàn)dmc中主莖基部的分蘗分化和發(fā)育都受到嚴重抑制（圖4A-E）。在兩葉期，dmc和國麥301在外部形態(tài)上幾乎沒有差異。組織學觀察發(fā)現(xiàn)，國麥301的分蘗原基已經(jīng)開始分化（圖4F），但在dmc中未觀察到分蘗原基（圖4A）。在三葉期，國麥301的分蘗芽開始生長，在主莖基部形成兩個一級分蘗（圖4G），而在dmc基部僅形成一個微小的突起（圖4B）。在四葉期，國麥301的主莖變長且增厚，分蘗原基增多（圖4H，圖5A）。同時期的dmc的主莖也伸長，可以觀察到一個微小的分蘗原基在基部（圖4C）。在越冬期，dmc平均株高（在自然狀態(tài)下的最高離地高度）僅為12cm，是國麥301平均株高的一半（圖5B）。組織學觀察發(fā)現(xiàn)在dmc基部只有兩個小分蘗原基（圖4D），但國麥301處于分蘗旺盛期，分蘗數(shù)約為12-14個，分蘗主要由一級分蘗和二級分蘗組成（圖4I）。在起身到拔節(jié)階段，dmc的分蘗幾乎與前期一樣很小（圖4E）。然而，國麥301的分蘗數(shù)已達到最大值（圖4J, 圖5C）。大多數(shù)dmc最終只有一個主莖（圖5C）。

 

 

  （A、B、C、D、E：二葉期、三葉期、四葉期、越冬期和起身到拔節(jié)期之間的dmc；F、G、H、I：二葉期、三葉期、四葉期和越冬期的國麥301；J：起身到拔節(jié)期之間的國麥301的部分分蘗芽。MC：主莖；TP：分蘗原基；PT：一級分蘗；ST：二級分蘗。A-H，比例尺=1 mm；I和J，比例尺=1cm。）

 

      ?2.4 國麥301和突變體dmc的組織化學觀察

 

      在組織化學水平上，三葉期突變體dmc的分蘗原基與國麥301的分蘗原基有明顯區(qū)別。dmc中通常只有一個小的分蘗突起，被染成淡黃紫色；相反，國麥301通常有兩個分蘗芽，里面包裹著分蘗原基，被染成深黃色。這些表型說明國麥301的分蘗原基蛋白質含量明顯高于dmc。此外，在國麥301的橫切面上，有兩個明顯的黃色區(qū)域，即旺盛分蘗的原基部位。國麥301分蘗原基細胞排列整齊，胞質致密被染成深黃色，呈現(xiàn)典型的分生組織特征。然而，在dmc橫切面中通常看不到分蘗原基及分生組織。總之，dmc分蘗原基少且分蘗原基蛋白質含量低于對照國麥301（如圖4）。

 

      （A：dmc（箭頭）分蘗的縱切面；B：國麥301（箭頭）分蘗的縱切面；C：dmc分蘗基部的橫切面；D：國麥301分蘗基部的橫切面；E：C的放大圖；F：D的放大圖。TP：分蘗原基；TB：分蘗芽。
 

 

圖5 三葉期的國麥301和dmc小麥分蘗中淀粉（紫色）和蛋白質（黃色）的分布

 

      ?2.5 突變體dmc遺傳學初步分析

 

      突變體dmc與中國春進行雜交，對F?進行性狀調查，結果發(fā)現(xiàn)F?分蘗均減少，平均分蘗4.48個，而F?株高介于兩親本之間。初步推測突變體dmc的獨稈性狀可能是由顯性或半顯性基因控制。

 

表2 突變體dmc、中國春及其F1代的株高和分蘗性

 

 

      3 小麥提前終止穗分化突變體ptsd1遺傳調控機制研究

 

      ?3.1突變體ptsd1表型分析

 

      突變體ptsd1的平均株高和穗長分別為50.75cm和4.19cm，與親本國麥301相比分別降低了21.1%和縮短了60.0%。突變體ptsd1的平均可育小穗數(shù)和單穗籽粒數(shù)為4.50和14.16，與親本國麥301相比分別減少了77.5%和77.9%。千粒重相比于親本降低了19.8%。突變體ptsd1的抽穗期、開花期和成熟期分別推遲了9天、9天和11天。突變體ptsd1主要影響穗長和小穗數(shù)性狀（圖6）。

 

 

圖6 對照國麥301和突變體ptsd1整株表型（A）和穗部表型（B）

 

      ?3.2 突變體ptsd1幼穗分化的超微結構

 

      對照國麥301頂端小穗形成期幼穗超微結構顯示（圖8A），頂端分生組織（im）分化形成最后幾個頂端小穗原基，上部小穗原基已經(jīng)分化形成護穎原基、外稃原基和小花原基凸起，中部小穗中的小花原基已經(jīng)分化形成三個雄蕊原基凸起（stp）和一個雌蕊原基凸起（pip）。突變體ptsd1只有約5個小穗原基正常分化（圖8B），小穗中的小花原基分化形成三個雄蕊原基凸起（stp）和一個雌蕊原基凸起（pip），而上部小穗原基停止分化，最終形成一個個凸起狀結構。經(jīng)過越冬期，頂端分生組織逐漸從營養(yǎng)生長階段向生殖生長階段過渡，頂端圓錐體迅速伸長（圖7 A、A'）；在二棱期（圖7 B、B'），對照國麥301和突變體ptsd1在都形成小穗脊（spr）結構；在二棱后期（圖7 C、C'），對照的穗軸兩側小穗原基（spp）逐漸開始膨大，首先觀察到中部小穗原基的膨大，然后向頂端和基部延伸，而突變體ptsd1的上部小穗原基停止分化，下部小穗原基逐漸開始膨大；在護穎原基形成期（圖7 D、D'），對照護穎原基（glp）逐漸形成，大約形成12 ~ 14個小穗原基，而突變體ptsd1只形成6 ~ 8個小穗原基；在外稃原基形成期（圖7E、E'），對照在護穎原基上方形成了外稃原基（lemp），大約形成14 ~ 16個小穗原基，而突變體ptsd1只形成6 ~ 8個小穗原基，上部小穗原基仍停留在二棱期；在小花原基形成期（圖7 F、F'），中部小穗的第一個小花原基（flp）分化形成，小花原基位于外稃原基上方，呈半球狀，大約形成16 ~ 18個小穗原基，而突變體ptsd1只形成6 ~ 8個小穗原基，上部小穗原基仍停留在二棱期；在頂端小穗形成期（圖7 G、G'），在這個時期對照除了最后幾個頂端小穗原基分化外，不再形成新的小穗原基，而突變體ptsd1上部小穗原基仍停留在二棱期；在小穗原基分化結束后，對照小花原基逐漸開始分化最終形成雌蕊和雄蕊（圖7H、I、J和K），突變體ptsd1下部小花原基正常分化形成雌蕊和雄蕊，而突變體ptsd1上部未分化的小穗原基沒有分化形成小花原基及隨后的雌雄蕊（圖7 H'、I'、J'和K'）。在綠色花藥時期，對照國麥301的上、中和下部小穗中均觀察到正常的雌雄蕊形態(tài)（圖7 L、M和N），而突變體ptsd1上部小穗原基未分化沒有形成雌雄蕊（圖7L'），突變體ptsd1的中部和下部小穗中均觀察到正常的雌雄蕊形態(tài)（圖7M'和N'）。觀察記錄穗發(fā)育時期發(fā)現(xiàn)，突變體ptsd1頂端圓錐體比囯麥301晚11天進入二棱期，且整個穗分化進程延遲了11天。

 

 圖7 對照國麥301（A-N）和突變體ptsd1（A'-N'）的穗分化不同時期形態(tài)

 

      注：A：二棱初期，B：二棱期，C：二棱后期，D：護穎原基形成期，E：外稃原基形成期，F(xiàn)：小花原基形成期，G：頂端小穗形成期，H：雌雄蕊原基分化期，I：雌雄蕊原基分化末期，J：外稃完全包裹基部兩個小花，K：綠色花藥時期，L-N：綠色花藥時期對照國麥301的上、中和下部雌雄蕊形態(tài)。A'-N': 突變體ptsd1與對照發(fā)育時期一一對應。spr，小穗脊；spp，小穗原基；spd，小穗分生組織的圓頂；glp，護穎原基；lemp，外稃原基；flp，小花原基；ts，頂部小穗；an，花藥。紅色括號標注的是從二棱期開始突變體ptsd1上部小穗原基不分化。小麥穗發(fā)育時期參考文獻。

 

 

注：Im，花序分生組織；stp，雄蕊原基；pip，雌蕊原基

 

圖8 對照國麥301（A）和突變體ptsd1（B）頂端小穗形成期幼穗超微結構

 

      ?3.3 遺傳分析

 

      突變體ptsd1與周麥18雜交組合，正反交F?穗長正常（圖9A-D），表明控制穗長性狀位點為隱性基因。“ptsd1 × 周麥18”雜交F?，穗長性狀分離為三種表型，正常穗（NSL）、中等縮短穗（MSL）和極端縮短穗（ESL）。其中，正常穗的長度與親本周麥18穗長相當，中等縮短穗的長度介于周麥18和突變體ptsd1之間，極端縮短穗的長度與突變體ptsd1相當。統(tǒng)計595個F?單株穗長表型發(fā)現(xiàn)，正常穗、中等縮短穗和極端縮短穗分別為503、68和24個單株（表3）。假設穗長由一對隱性基因控制，統(tǒng)計正常穗和中等縮短穗（NSL和MSL）為571株，極端縮短穗（ESL）為92株，χ2檢驗結果顯示χ2 ＞ P0.05，不符合孟德爾單基因遺傳3:1的分離比，因此突變體ptsd1不是單基因隱性遺傳。假設穗長由兩對隱性基因控制，χ2檢驗結果顯示χ2 ＞ P0.05，不符合15:1的分離比，因此突變體ptsd1也不符合孟德爾兩對獨立的隱性基因遺傳。

 

 

      圖9 對照國麥301（A）、突變體ptsd1（B）、周麥18（C）、ptsd1與周麥18正反交F?（D）以及后代F?或F2:3穗部形態(tài)（E-H）。

 

表3  F?群體穗長性狀遺傳分析

 

 

      ?3.4 結論

 

      周麥18和中國春分別與突變體ptsd1雜交，F(xiàn)?穗型都正常，表明ptsd1控制穗長性狀是由隱性基因控制的。在F?和F2∶3群體中，正常和突變植株的分離比不符合經(jīng)典孟德爾遺傳學的1對隱性基因或2對獨立分配、自由重組的隱性基因遺傳的理論分離比。表明突變體ptsd1中，穗長性狀不是由一對隱性基因也不是由兩對獨立遺傳隱性基因控制。660K芯片SNP標記連鎖分析和SSR標記連鎖分析表明，在5A染色體的短臂和長臂上各有一個突變位點。因為這兩個突變位點在同一條染色體上，存在基因連鎖，所以遺傳分離比不符合15:1。為此，ptsd1是首次發(fā)現(xiàn)的在5A染色體上同時存在兩個基因控制穗分化的突變體。未來，我們將把這兩個基因分解到不同的作圖群體中，從而對每個基因進行圖位克隆。

 

      基于目前的研究結果，構建了突變體ptsd1的遺傳模型（圖10）。將兩對基因的四種基因型分別用A、a、B和b代替，如A：Ptsd1-5AS，a：ptsd1-5AS，B：Ptsd1-5AL和b：ptsd1-5AL。突變體ptsd1攜帶兩對隱性基因aabb，正常穗長植株攜帶兩對顯性基因AABB，雜交F?基因型為AaBb。F?自交兩代，在F2∶3篩選穗長分離的家系。根據(jù)F2∶4的分離情況，確定F2∶3家系單株是否純合。篩選純和的正常穗基因型AABB和極端縮短穗基因型aabb純合株系構建BSA混池，本研究篩選獲得的連鎖標記都是基于這兩個混池。

 

      將兩個基因分解到兩個遺傳群體的方法有以下兩種：

 

      1）篩選穗長性狀分離的雜合F2∶3植株，根據(jù)連鎖標記鑒定F2∶3中基因型為aaBb和Aabb的單株，自交一代得到F2∶4家系群體為一個基因純合，另一個基因分離的遺傳群體；

 

      2）篩選穗長性狀不分離的純合F2∶3植株，根據(jù)連鎖標記鑒定F2∶3中基因型為aaBB和AAbb的單株，與突變體ptsd1回交一代得到基因型為aaBb和Aabb的單株，自交后獲得單個基因的遺傳群體。

 

 

圖10 突變體ptsd1的遺傳模型

 

      來源：一麥眾承