基因組編輯技術(shù)通過使用序列特異性核酸酶（sequence-specific nucleases, SSN），在目標(biāo)基因組序列中產(chǎn)生位點(diǎn)特異性雙鏈斷裂（site-specific double-strand breaks, DSB），然后利用內(nèi)源性DSB修復(fù)機(jī)制在目標(biāo)區(qū)域產(chǎn)生各種突變。三種類型的SSN用于在選定位點(diǎn)引入DSB，包括鋅指核酸酶、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶和CRISPR/Cas（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated protein）（Zhan et al. 2021）。隨后，DSB主要通過兩種途徑修復(fù)，非同源末端連接（nonhomologous end joining，NHEJ）和同源重組（homology-directed repair，HDR）（Li et al. 2021c）。在NHEJ中，兩個(gè)斷裂的末端被簡單地重新連接，在目標(biāo)位點(diǎn)產(chǎn)生插入和/或缺失。當(dāng)DSB中存在同源供體序列時(shí)，可以使用HDR修復(fù)，并可進(jìn)行基因修飾（Li et al. 2021c）。SSN誘導(dǎo)的DSBs大多數(shù)是通過NHEJ進(jìn)行修復(fù)，少數(shù)是通過HDR修復(fù)。

 

      CRISPR/Cas系統(tǒng)在細(xì)菌和古細(xì)菌中用來防御外來質(zhì)粒或病毒DNA元件。根據(jù)Cas基因的種類和干擾復(fù)合物的性質(zhì)，它們分為六種類型（Hille et al. 2018）。II型CRISPR/Cas系統(tǒng)具有三個(gè)成分，即成熟的crRNA、tracrRNA和Cas9，負(fù)責(zé)切割的外來DNA。為了簡化系統(tǒng)，可將雙tracrRNA:crRNA設(shè)計(jì)為單向?qū)NA （single guide RNA, sgRNA），以引導(dǎo)Cas9在體外產(chǎn)生DSB。近來，Awan et al.（2022）開發(fā)了一種RNA介導(dǎo)的基因組編輯工具CRISPR/Cas9來進(jìn)行靶向突變。CRISPR/Cas9包含兩個(gè)主要成分：負(fù)責(zé)識(shí)別靶DNA的sgRNA和負(fù)責(zé)在預(yù)先設(shè)計(jì)的靶DNA位點(diǎn)生成DSB的Cas9內(nèi)切酶。來自化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的Cas9（SpCas9）是第一個(gè)被充分研究的RNA引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶。它是一種多功能蛋白質(zhì)，包含兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域：HNH結(jié)構(gòu)域和RuvC-like結(jié)構(gòu)域（Li et al. 2021b）。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分別切割DNA的一條鏈，產(chǎn)生平末端DSB，DSB觸發(fā)DNA修復(fù)系統(tǒng)，從而產(chǎn)生靶向突變體。將CRISPR/Cas9應(yīng)用于靶向突變的唯一條件為靶點(diǎn)處需存在PAM（protospacer-adjacent motif）。對(duì)于SpCas9來說，PAM序列為NGG，對(duì)于不同的靶位點(diǎn)，只需改變sgRNA中的引導(dǎo)序列即可用于靶位點(diǎn)編輯（Li et al. 2021b）。

      

      2   CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在小麥性狀改良中的應(yīng)用

 

      迄今為止，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)已經(jīng)在小麥中廣泛應(yīng)用，主要應(yīng)用于提高小麥產(chǎn)量、品質(zhì)和抗逆性。例如，脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）在植物生長發(fā)育、病原菌防御和損傷應(yīng)激等方面具有多種功能。敲除TaLOX2改變了小麥的籽粒大小和重量，提高了小麥的耐貯性（Shan et al. 2014; Zhang et al. 2016）。敲除RING型E3連接酶編碼基因TaGW2增加了小麥籽粒的長度和寬度，從而提高了籽粒產(chǎn)量（Li et al. 2021c）。最近，在冬小麥品種鄭麥7698和春小麥品種Bobwhite中利用CRISPR/Cas9對(duì)TaSBEIIa進(jìn)行靶向誘變，獲得了高直鏈淀粉小麥，為培育營養(yǎng)價(jià)值更高的小麥新品種提供了新途徑（Li et al. 2021a）。此外，利用CRISPR/Cas9技術(shù)可改良小麥抗病性，例如通過編輯小麥TaMLO基因獲得抗白粉病小麥材料（Wang et al. 2014）。

 

      普通小麥?zhǔn)怯葾、B和D亞基因組組成的六倍體作物，同時(shí)突變位于多個(gè)基因組位點(diǎn)的多個(gè)基因具有挑戰(zhàn)性。因此，開發(fā)一種高效的CRISPR/Cas9介導(dǎo)的多重基因組編輯策略來破譯復(fù)雜性狀并促進(jìn)小麥改良具有重要意義。近來，利用多順反子tRNA策略已成功地在中國優(yōu)良小麥品種中建立了高效的CRISPR/Cas9多重基因組編輯系統(tǒng)。研究人員以控制穗發(fā)芽抗性、氮吸收利用、株型、支鏈淀粉合成和磷轉(zhuǎn)運(yùn)的6個(gè)基因作為靶基因，分別構(gòu)建同時(shí)靶向2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)和5個(gè)基因組合的多基因編輯載體，以黃淮麥區(qū)大面積種植的小麥品種鄭麥7698為受體材料，實(shí)現(xiàn)15個(gè)基因組位點(diǎn)同時(shí)編輯，獲得了2、3、4、5個(gè)基因編輯植株，最高編輯效率可達(dá)50%。進(jìn)一步通過胚拯救和后代分離，成功獲得了無轉(zhuǎn)基因、多個(gè)優(yōu)異等位基因聚合的小麥新種質(zhì)（Luo et al. 2021）。小麥高效、通用多基因編輯體系的建立，將有助于促進(jìn)小麥分子生物學(xué)研究和復(fù)雜性狀形成的網(wǎng)絡(luò)解析，定向創(chuàng)制小麥新種質(zhì)，加速育種進(jìn)程。

      

 

      病原菌侵染會(huì)顯著降低小麥產(chǎn)量和質(zhì)量，培育具有廣譜持久抗病品種是控制病害確保小麥生產(chǎn)安全的有效策略之一（Li et al. 2022a）。以CRISPR-Cas9為代表的基因組編輯技術(shù)為突變小麥感病基因改良抗病性提供了有力工具（Gao 2021）。感病基因根據(jù)其介導(dǎo)的感病機(jī)理的不同歸為3類，促進(jìn)病原菌的寄主識(shí)別和侵入的基因，編碼免疫信號(hào)負(fù)調(diào)節(jié)因子的基因，滿足病原菌代謝或結(jié)構(gòu)需求并促進(jìn)其在寄主體內(nèi)增殖擴(kuò)展的基因。感病基因的突變或缺失會(huì)限制病原菌侵染致病的能力（Garcia-Ruiz et al. 2021）。使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)靶向敲除小麥中的感病基因TaWRKY19和TaPsIPK1賦予了小麥對(duì)條銹菌的廣譜抗性（Wang et al. 2022b; Wang et al. 2022c）。值得關(guān)注的是，Tapsipk1突變體在田間試驗(yàn)中表現(xiàn)出對(duì)條銹菌的廣譜抗性且不影響產(chǎn)量，表明Tapsipk1突變體將成為未來小麥抗性育種的寶貴遺傳資源（Wang et al. 2022c）。利用TALEN系統(tǒng)靶向敲除小麥感病基因TaMLO和TaEDR1增強(qiáng)了小麥對(duì)白粉病的抗性（Wang et al. 2014; Zhang et al. 2017b）。有趣的是，由TALEN系統(tǒng)產(chǎn)生的小麥突變體Tamlo-R32賦予了強(qiáng)大的白粉病抗性而且沒有產(chǎn)量損失（Li et al. 2022b）。這些研究表明通過基因編輯突變小麥感病基因可以有效改良小麥抗病性。

 

      傳統(tǒng)的基因組編輯需要植物遺傳轉(zhuǎn)化和再生，這阻礙了在像小麥一樣遺傳轉(zhuǎn)化比較困難的植物中的應(yīng)用（Li et al. 2022a）。最近報(bào)道發(fā)現(xiàn)小麥WUSCHEL家族再生相關(guān)基因TaWOX5的過表達(dá)可以克服農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化對(duì)基因型的依賴并大大提高小麥轉(zhuǎn)化效率（Wang et al. 2022a）。過表達(dá)小麥生長調(diào)節(jié)因子GRF4（GROWTH-REGULATING FACTOR 4）與輔因子GIF1（GRF-INTERACTING FACTOR 1）的融合蛋白提高了轉(zhuǎn)基因小麥的再生效率（Debernardi et al. 2020）。這些新的小麥轉(zhuǎn)化再生技術(shù)顯著提高了通過基因組編輯技術(shù)突變小麥感病基因的效率。設(shè)計(jì)基于大麥條紋花葉病毒的sgRNA遞送載體，并通過病毒感染Cas9轉(zhuǎn)基因小麥植株，從而實(shí)現(xiàn)小麥可遺傳基因組編輯。這種既方便又無需組織培養(yǎng)的基因組編輯方法為突變小麥感病基因進(jìn)行抗病育種鋪平了道路（Li et al. 2021d）。此外，通過編輯感病基因產(chǎn)生的抗病性狀可以通過雜交引入優(yōu)良小麥品種，而先進(jìn)的基因組育種方法如標(biāo)記輔助選擇和標(biāo)記輔助回交（marker-assisted backcrossing）可加快這一進(jìn)程（Li et al. 2022a）。2022年1月24日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布農(nóng)業(yè)用基因編輯植物安全評(píng)價(jià)指南（試行），自此研究專家可以通過基因編輯技術(shù)開發(fā)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病性強(qiáng)的小麥品種。在中國獲得轉(zhuǎn)基因作物生物安全許可大約需要6年左右，新發(fā)布的指南規(guī)定獲得基因編輯作物生物安全證書可縮短至2年左右。農(nóng)業(yè)用基因編輯植物安全評(píng)價(jià)指南（試行）發(fā)布將極大推進(jìn)通過突變小麥感病基因培育小麥抗病品種的進(jìn)程。盡管過去幾十年在鑒定小麥感病基因方面取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，但要完全揭示小麥感病的分子機(jī)制并改造感病基因以獲得小麥的廣譜抗病，我們還有很長的路要走。

      

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      作者簡介：

      

      郭軍，男，博士，教授。目前在西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院工作，主要從事小麥條銹病持久控制的基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究。

      

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