近日，中國(guó)水稻研究所水稻染色體工程及基因組編輯創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)與蘇州大學(xué)黃健課題組合作，創(chuàng)建了一種簡(jiǎn)單高效的基因編輯突變體篩選方法。相關(guān)研究成果于4月4日在線發(fā)表于《遺傳學(xué)與基因組學(xué)（Journal of Genetics and Genomics）》雜志。

 

    隨著CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)的廣泛應(yīng)用，科研人員需要進(jìn)行大量的突變體篩選工作。目前通常的篩選方法包括對(duì)PCR產(chǎn)物限制性酶切、T7E1酶切、PAGE分析、溶解曲線分析等，這些方法存在著耗時(shí)費(fèi)錢(qián)、位點(diǎn)特異或者需要特定儀器等缺點(diǎn)。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單高效的篩選方法。

 

    PCR是分子生物實(shí)驗(yàn)的一種常規(guī)技術(shù)，主要由變性—退火—延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。其中，特異性的引物以及適宜的退火溫度是PCR反應(yīng)能否成功擴(kuò)增的關(guān)鍵因素?？蒲腥藛T通過(guò)設(shè)計(jì)基因編輯位點(diǎn)特異引物，首先以野生型脫氧核糖核酸（DNA）為模板進(jìn)行一次梯度PCR尋找出特異引物的臨界退火溫度，再在臨界退火溫度下進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選突變體。由于該特異引物不能和突變體DNA嚴(yán)格匹配，導(dǎo)致在臨界退火溫度下突變體中的PCR反應(yīng)不能有效進(jìn)行擴(kuò)增。因此最終只需進(jìn)行一次常規(guī)的PCR反應(yīng)，便可以靈敏地檢測(cè)出成功編輯的突變體。利用ACT-PCR，研究人員不僅在水稻中快速鑒定出單突變體和多突變體，同時(shí)也在斑馬魚(yú)中成功鑒定出突變體，表明ACT-PCR的應(yīng)用不受物種的限制。除用于基因編輯突變體鑒定之外，研究還發(fā)現(xiàn)結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，ACT-PCR還可用于定量計(jì)算在細(xì)胞系中進(jìn)行的基因編輯效率，與常用的PCR產(chǎn)物酶切等方法相比，通過(guò)定量ACT-PCR得到的數(shù)據(jù)更為接近于真實(shí)的編輯效率。

 

    該研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金以及中國(guó)農(nóng)科院科技創(chuàng)新工程經(jīng)費(fèi)資助。水稻所所華宇峰、王春和蘇州大學(xué)黃健為該論文的共同第一作者，王克劍研究員為通訊作者。（通訊員 陳鎏琰）

 

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    http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1673852717300577