DNA身份鑒定 解密品種“黑匣子” |
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《 農民日報 》（ 2015年06月01日 06 版） 編者按針對目前我國農作物品種身份鑒定手段落后、套牌侵權、珍貴種質資源流失等問題，農業(yè)部辦公廳于近日印發(fā)了《農作物品種DNA身份鑒定體系構建實施方案》，將在已有種質資源庫基礎上，構建全國統一的品種DNA信息數據庫及品種身份查詢平臺，實現品種身份可鑒定、信息可查詢、資源可保護、材料可流通、成果可交易、種子可追溯。品種管理的DNA鑒定模式由此開啟。 |
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鏈接 第一，全基因組測序并不適合直接用于品種鑒定中。品種鑒定主要是尋找樣品間差異的過程，在全基因組水平上，品種間甚至物種間絕大部分堿基序列是相同的，如人類與靈長類全基因組序列98%以上核苷酸相同，DNA序列中無差異的部分對于品種區(qū)分沒有實際意義。 第二，基因組測序，僅針對某個基因組如葉綠體基因組、線粒體基因組以及外顯子區(qū)測序等方法也不適合用于品種鑒定中。 第三，基于第二代測序技術進行SNP基因分型方法，或者利用Nimblegen序列捕獲芯片技術，設計探針捕獲到目的SNP區(qū)域片段，在基于測序技術檢測基因型。隨著測序技術的發(fā)展和成本的降低，機遇測序技術檢測SNP的方法具有一定發(fā)展?jié)摿Α?/p> DNA指紋鑒定技術的發(fā)展歷程？ 隨著現代生物技術發(fā)展，品種鑒定技術從形態(tài)鑒定進入到DNA指紋技術水平。品種指紋鑒定技術發(fā)展經歷了3個重要階段：20世紀90年代的第一代標記技術RELP（限制性片段長度多態(tài)性）和PARD（隨機擴增多態(tài)性），21世紀初興起的第二代標記技術SSR（簡單重復序列），近幾年啟動研究的第三代標記技術SNP（單核苷酸多態(tài)）。其中，SSR和SNP被UPOV的BMT分子測試指南推薦作為品種鑒定和數據庫構建的優(yōu)選標記。 采用不同器官組織提取DNA對品種鑒定有無影響？ DNA指紋技術通過鑒別不同品種間遺傳物質DNA的堿基組分、排列順序不同，從而區(qū)分不同品種。對于一個玉米品種而言，從其種子、幼苗、葉片、苞葉中提取的DNA代表了該品種的基因組序列特征，對DNA指紋鑒定的結果準確性不會產生任何影響；但從雜交種種子果皮上提取的DNA和從雜交制種天母本植株所結的果穗籽粒提取的DNA并不能代表該品種的基因組序列特征，會嚴重影響該品種的DNA指紋鑒定結果準確性。 品種分子監(jiān)測與轉基因檢測有何異同？ 相同之處是應用的技術手段基本相同。 不同之處，一是品種真實性及純度鑒定的分子檢測是對品種的整體遺傳背景的監(jiān)測，具體選用的引物位點因所鑒定的物種不同而不同；轉基因檢測是對目的基因的監(jiān)測，具體引物位點的選擇因所鑒定的基因而不同，與物種無關。二是兩種檢測項目在實驗污染控制方面是不同的，造成污染的原因也不同。種子真實性和純度檢測污染主要出現在樣品準備階段，環(huán)境中的外源核酸一般不會對其檢測結果產生影響；而轉基因檢測主要污染出現在PCR擴增階段，環(huán)境中的外源核算容易導致檢測結果出現假陽性。 ——摘編自中國農業(yè)科學技術出版社《玉米品種DNA指紋鑒定技術100問》 |
給種子做個“親子鑒定” ●DUS田間表型鑒定是對申請保護的植物新品種進行特異性、一致性和穩(wěn)定性的栽培鑒定試驗或室內分析測試的過程。測試方法是將申請品種與近似品種在相同的生長條件下，從植物的種子、幼苗、開花期、成熟期等各個階段對多個質量性狀、數量性狀及抗病性等作出觀察記載，并與近似品種進行結果比較。 ●DNA室內基因型鑒定是一項生物學檢測技術，以玉米為例，玉米有總數約為30億個堿基對的DNA，每個品種的DNA都不完全相同，品種與品種之間不同的堿基對數目達幾百萬之多，因此通過分子生物學方法顯示的DNA圖譜也有差異，由此可以識別不同的品種。 本報記者繆翼李國龍 如果將100個品種撕掉標簽和包裝，通過種子形態(tài)或者田間種植進行形態(tài)觀察讓它們一一對號入座，辨別出分別是什么品種，我想幾乎沒有人能夠做到，那成千上萬個品種就更不可能做到了。但利用DNA指紋技術識別這些品種就輕而易舉了，一天就可以完成。“這就是DNA鑒定技術既準確可靠，又經濟快捷的優(yōu)勢。”北京市農林科學院玉米研究中心主任趙久然的信心來自于他們團隊20余年持之以恒的關于玉米標準DNA技術的研究與應用。 農業(yè)部辦公廳日前發(fā)布了《農作物品種DNA身份鑒定體系構建實施方案》，明確了農作物品種DNA身份鑒定體系構建的重要意義和發(fā)展方向。 且說快和準 難以想象僅2014年一年時間里，玉米中心做過的DNA指紋檢測鑒定樣本量達1萬多份。“正常程序是7個工作日之內出結果，加急樣品48小時內出結果。”檢測中心王鳳格博士說，“無論是已審定的、參加過區(qū)試的，還是提交品種權保護的品種，凡是在玉米中心做過檢測的，其‘指紋’和痕跡就會永久留存了。目前，這個標準指數庫已經保存了2萬多個玉米標準DNA指紋信息，未來還會進一步擴容。” 人類DNA鑒定技術的應用也有近20年了，通過人的DNA檢測可以進行親子鑒定，更可以用于刑事偵查中的DNA比對，已經成為公安機關有效的破案利器。作物與人都屬于生物，遺傳信息載體都是DNA，很多技術是相通的，但也有不同之處。趙久然解釋，在人類DNA檢測結果判別上，引入最大似然率概念，就是說兩個樣本的DNA鑒定結果完全一樣，也存在著極小概率不是同一個人的可能性。而在玉米品種判定中，沒有使用“最大似然率”這個概念，采用了“高度近似”這個概念。就是說如果兩個品種的DNA鑒定結果相同，其判定結論是“相同或高度近似”，有可能不同，但即使有些許差異，這種差異也是很小的，頂多屬于派生品種范疇。如果把兩個品種種在一起，連育種者自己都分不清哪個是他育成的品種，還能說那是一個新品種嗎？“同”是相對的，“不同”是絕對的，沒有兩個絕對相同完全一樣的事物，關鍵是確定和把握好尺度。 |
遏制“仿冒套” 有人說“市場上至少1/3的種子是假冒的。”有人感慨“新品種培育六七年，仿冒才幾天。”業(yè)內認為“仿冒套”傷的是種業(yè)創(chuàng)新力，呼吁通過DNA身份鑒定這項技術支撐，能夠對“仿冒套”起到遏制作用，鼓勵真正的品種創(chuàng)新，引導市場走向自律。 人靠相貌等可以辨別，而DNA鑒定是最終途徑。農作物也是一樣，由于少數具備高產、廣適、抗病等特性的親本被集中應用，在原品種基礎上稍作修改的派生品種越來越多，品種間的遺傳差異是肉眼所難以辨別的，這時就需要DNA來鑒定其身份了。 例如山東濟南中院受理先鋒公司告某公司生產的“費玉3號”侵犯“先玉335”品種權案，經玉米中心DNA檢測，“費玉3號”與農業(yè)部“先玉335”標準樣品比較，在40個位點上位點差異為1，被告未提出有利證據證明不是同一品種，判決被告停止侵權并賠償原告經濟損失。 “依據玉米DNA指紋檢測標準，如果差異位點數≥2，證明為不同品種；差異位點數≤1，則證明品種相同或高度近似。”趙久然說，“這其中是留有框量的，但是基本不給‘仿冒套’鉆空子的余地。” 不是隨便“抓一把” 玉米有30億個堿基對，憑什么僅靠目前的40個位點檢測結果，就能判斷清楚？ 對此，趙久然說，這40個位點不是隨便“抓一把”。2001年起確立了核心引物組合法的品種鑒定方案，從2001年~2005年，經過4年多系統篩選和重新設計，形成了一套共40個位點適于玉米品種鑒定的SSR（簡單重復序列）引物組合，這些位點都存在等位基因，在不同品種間存在著明確的差異，這些差異組合就可以組合出巨大的天文數字。在此基礎上研制出國內首個和唯一的適合玉米品種真實性檢測的的DNA指紋復合擴增試劑盒專利產品。利用這套引物，僅玉米中心就開展了近5萬份樣品的真實性檢測，充分檢驗了40個引物的有效性。 SNP（單核苷酸多態(tài)性）技術是否就此取代了SSR技術在DNA身份鑒定測試中的應用？ “實際上是推廣一代，研究一代。”趙久然說，每種標記技術都在特定時期內對品種檢測工作發(fā)揮一定作用，其中SSR和SNP由于均為共顯性遺傳、染色體定位清楚、具有高通量自動化的潛力而被UPOV的BMT分子測試指南推薦作為品種鑒定和數據庫構建的優(yōu)選標記。趙久然認為，兩種標記技術均是比較適合品種指紋分析的標記，其中SSR標記可以滿足大部分樣品快速低成本的進行真實性檢測的要求，而SNP標記可以對其中鑒別困難的派生品種進行精細鑒別，兩種標記技術各自具備優(yōu)缺點，可優(yōu)勢互補，未來將長期并存應用。 |
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盧洪 國務院2011年8號文件把種業(yè)定義為國家基礎性、戰(zhàn)略性核心產業(yè)，種業(yè)安全是我國糧食安全的重要保障。為了進一步激發(fā)種業(yè)科技創(chuàng)新活力，創(chuàng)建公平競爭的市場環(huán)境，加強種質資源保護、品種權保護與管理，按照《國務院辦公廳關于深化種業(yè)體制改革提高創(chuàng)新能力的意見》的要求，急需構建適應現代需求的以玉米為代表的農作物品種DNA身份鑒定體系。 同時，隨著現代分子生物學的不斷進步，尤其是近年來基因組學的發(fā)展，使利用基因組學的研究成果進行玉米品種管理和種子質量檢驗已經成為可能。另外，移動互聯、大數據引發(fā)的產業(yè)變革，為品種管理向田間表型身份鑒定與室內基因型身份鑒定相結合的方向發(fā)展提供了有力的技術支撐?，F代種業(yè)的發(fā)展對品種管理的數字化、便捷化、智能化提出了更高的要求，可以看出，構建以玉米為代表的主要農作物品種DNA身份鑒定體系構建具有非常重要的意義。 近20年來，以基因組學，高通量DNA測序技術和生物信息學為代表的現代生物技術科學獲得了突飛猛進的發(fā)展，這些技術為建設以SNP檢測為基礎的新一代DNA身份鑒定體系打下了堅實的基礎。因此，建設新一代玉米DNA身份鑒定體系從技術上已經完全成熟。 具體來講，新一代玉米DNA身份鑒定體系主要包括針對3種不同類型資源-品種身份鑒定、育種材料確權、種質資源評價分別建立SNP鑒定標準。具體工作包括： 篩選適用于品種身份鑒定、育種材料確權、種質資源評價的不同檢測目的的SNP位點組合。根據解決品種身份鑒定、育種材料確權、種質資源評價3類不同鑒定內容，分別制定SNP位點篩選原則、位點數目、位點組合等。 制定玉米品種SNP身份鑒定、育種材料確權、種質資源評價的檢測技術規(guī)范。借鑒國際做法，依托SNP技術，在DNA樣品制備、檢測平臺選擇、結果表述、判定閾值等問題分別進行研究，制定適用于玉米品種身份鑒定、育種材料確權、種質資源評價3類不同目的的SNP分子標記檢測技術規(guī)范。 玉米品種DNA身份鑒定體系技術驗證。由全國農技中心、農業(yè)部科技發(fā)展中心分別組織相關檢測機構、DUS測試中心等單位對玉米DNA身份鑒定位點組合和技術規(guī)范進行多實驗室間驗證。技術驗證方案：制定和分發(fā)統一的技術操作規(guī)范、結果報告格式和驗證樣品，在不同實驗室之間對利用相同位點組合構建SNP指紋數據的一致性驗證，對品種鑒定結果的一致性驗證。由項目主持單位匯總提交驗證總結報告，全國農技中心、科技發(fā)展中心對提交的報告進行比對、分析及驗收。 建立玉米品種DNA身份信息數據庫及品種身份查詢平臺。依據制定的技術規(guī)范，建立玉米品種DNA身份信息數據庫包括育成品種、育種材料、種質資源三大類樣品的DNA身份信息。玉米DNA指紋數據庫構建需重點研究確定指紋質量保證和數據庫管理使用問題，同時解決不同分子標記技術、不同檢測技術（芯片技術、測序技術、熒光掃描技術、電泳技術等）數據采集、數據結構格式不同的問題，實現數據可整合共享。 （作者系中玉金標記北京生物技術股份有限公司總裁） |
SNP檢測可實現全程自動化 張健 國以農為本，農以種為先。培育和生產優(yōu)良的種子是種業(yè)的核心任務，而我國目前的種業(yè)市場存在品種間同質化嚴重、套牌侵權泛濫、種子質量良莠不齊等問題，育種單位間的種質資源難以正常流動，但育種材料流失依然嚴重，這些問題嚴重制約著我國現代種業(yè)的發(fā)展。解決這些問題的根本在于對種質資源、育種材料和作物品種進行有效保護，從DNA水平上對農作物品種和材料進行鑒定是實施品種保護的基礎。 目前，SNP檢測作為最新的分子標記檢測方法，已被眾多國際組織，如國際種子檢驗協會（ISTA）、國際植物新品種保護聯盟（UPOV）、國際種子聯盟（ISF）等，推薦為DNA水平上品種鑒定的方法。杜邦先鋒、孟山都和先正達等國際一流農業(yè)公司也都采用了SNP標記對內部的育種材料和不同品種進行分類鑒定。農業(yè)部最近印發(fā)的《農作物品種DNA身份鑒定體系構建實施方案》也標志著我國DNA水平上的品種鑒定將實施采用SNP技術。 我們知道，不同人在基因水平上是有很大差異的。同樣，同一作物的不同品種在DNA水平上也有很多差異，SNP是由單個核苷酸（A,T,C,G）的改變而引起的DNA序列的變化。例如在一個品種中某一位點上的核苷酸是A，但在另一品種中則變成了T，這種單核苷酸水平上的變化可以穩(wěn)定遺傳，并能通過一定手段被準確檢測。品種之間也有不少位點存在著這樣的穩(wěn)定差異，通過比較不同的SNP位點就可有效區(qū)分不同的品種和育種材料。 目前常用的SNP檢測方法有3種： 高通量SNP檢測。用PCR的方法特異擴增目標位點，在反應體系中加上能區(qū)分SNP型的熒光引物或探針，反應完成后通過檢測熒光信號就可以判斷該SNP位點上核苷酸類型。這種檢測方法已經非常成熟，全程可使用自動化技術，檢測過程無需人為干預，因而具有成本低、可重復性高、快速準確可靠等特點，非常適合對大量樣本的SNP檢測。華智水稻生物技術有限公司引進的LGCSNPLine系統和道格拉斯的ArrayTape系統即屬于該類，可迅速檢測幾百到幾萬份樣本中的SNP位點。 SNP芯片技術。將大量的SNP探針固定在一張芯片上，將品種樣本DNA與芯片雜交，通過采集芯片上的熒光信號，可一次檢測該品種中成千上萬個SNP位點。目前市面上已有Affymetrix和Illumina公司提供SNP芯片和相應設備。比較而言，SNP芯片技術檢測一個樣本的成本較高。 測序檢測。該方法通過對全基因組或目標位點擴增后進行測序，直接讀取相關位點的核苷酸堿基類型，從而可檢測出不同品種間的SNP位點差異。該方法能產生大量的序列數據，可能發(fā)現一些未知的DNA變異，但需要專業(yè)的生物信息分析，目前成本相對比較高，技術的成熟度也不如前兩種。 高通量SNP檢測方法對DNA樣本的質量要求不高，可使用全自動設備提取的DNA樣本，操作簡捷快速。SNP檢測過程全程自動化操作，無需開蓋操作，不僅結果準確，重復性高，還能降低人工和試劑的成本，其功能類似于識別品種身份的“讀卡器”。 （作者系華智水稻生物技術有限公司總經理） |
